Conformational changes in casein micelles during demineralization of skim milk by electrodialysis with ion exchange membranes


Kimura, T.; Uchida, Y.; Tomizawa, A.; Hiraoka, Y.; Fukushima, M.; Taneya, S.

Nippon Nogeikagaku Kaishi 65(8): 1213-1222

1991


Casein micelles in skim milk were dissociated into sub-micelles during demineralization, and the relationship between the amount of minerals and distribution casein micelles was studied. Ca and P amounts were determined as ionic, colloidal and binding phases. Casein micelle size-distributions were determined by ultracentrifugation, turbidity intensity and electron microscopy. The skim milk demineralization process in electrodialysis using ion exchange membranes was divided by the Ca demineralization ratio and mole ratio Ca/P of binding casein into three stages: (1) 0-50%, 1.38-1.0; (2) 50-80%, 1.0 and (3) over 80%, under 1.0. Ionic mineral components were demineralized at the first stage, and the mineral components binding casein were demineralized at the second stage. The latter caused casein dissociation from a micelle to sub-micelle state, and decreased micelle size and increased colloidal Ca and P. The further demineralization of Ca binding casein proceeded while organic P remained, and the Ca/P ratio was under 1.0. The size of the casein micelles was reduced during demineralization. The minimum casein micelle size during demineralization was at 80% Ca demineralization ratio measured by turbidity intensity. The amount of Ca binding casein decreased under demineralization ratio. The surface hydrophobicity of the casein particle was maximized at 80% demineralization ratio. The size of casein micelles increased at 90% Ca demineralization ratio because of coagulation of the submicelles.

1213
Nl
on
Nogeikagaku
Kaishi
Vol.65,
No.8,
pp.
1213-'-1222,
1991)
イオン交換膜電気透析法による脱脂乳脱塩過程の
カゼインミセルの形態変化
木村利昭,内田幸生,富沢
平岡康伸,福島正義,種谷真一
(雪印乳業株式会社技術研究所)
平成2年9月
6
受理
Conformational
Changes
in
Casein
Micelles
during
Demineralization
of
Skim
Milk
by
Electrodialysis
with
Ion
Exchange
Membranes
Toshiaki
KIMURA,
Yukio
UCHIDA,
Akira
TOMIZAWA,
Yasunobu
HIRAoKA
Masayoshi
FtJKUSHIMA
and
Shin'ichi
TANEYA
Technical
Research
Institute,
Snow
Brand
Milk
Products,
Co.,
1-1-2
Minamidai,
Kawagoe,
Saitama
350
Casein
micelles
in
skim
milk
were
dissociated
into
sub-micelles
during
demineralization,
and
the
relationship
between
the
amount
of
minerals
and
distribution
casein
micelles
was
studied.
Ca
and
P
amounts
were
determined
as
ionic,
colloidal
and
binding
phases.
Casein
micelle
size
distributions
were
determined
by
ultracentrifugation,
turbidity
intensity
and
electron
microscopy.
The
skim
milk
demineralization
process
in
electrodialysis
using
ion
exchange
membranes
was
divided
by
the
Ca
demineralization
ratio
and
mole
ratio
Ca/P
of
binding
casein
into
three
stages:
(1)
0-50%,
1.38-1.0;
(2)
50-80%,
1.0
and
(3)
over
80%,
under
1.0.
Ionic
mineral
com-
ponents
were
demineralized
at
the
first
stage,
and
the
mineral
components
binding
casein
were
demineralized
at
the
second
stage.
The
latter
caused
casein
dissociation
from
a
micelle
to
sub-micelle
state,
and
decreased
micelle
size
and
increased
colloidal
Ca
and
P.
The
further
demineralization
of
Ca
binding
casein
proceeded
while
organic
P
remained,
and
the
Ca/P
ratio
was
under
1.0.
The
size
of
the
casein
micelles
was
reduced
during
demineralization.
The
minimum
casein
micelle
size
during
demineralization
was
at
80%
Ca
demineralization
ratio
measured
by
turbidity
intensity.
The
amount
of
Ca
binding
casein
decreased
under
demineralization
ratio.
The
surface
hydrophobicity
of
the
casein
particle
was
maximized
at
80%
Ca
demineralization
ratio.
The
size
of
casein
micelles
increased
at
90%
Ca
demineralization
ratio
because
of
coagulation
of
the
sub-
micelles.
(Received
September
6,
1990)
食品工業で利用されている機能性分離膜には精密濾
過,限外濾過膜,逆浸透膜およびイオン交換膜がある.
イオン交換膜電気透析法はイオン交換膜の分離能を利用
し,電気ェネルギーを駆動力としてイオソ性物質を分離
する方法
a)
であるー実用的には海水の脱塩,砂糖,
アミ
ノ酸の精製,乳業界ではホェーや脱脂乳の脱塩に利用さ
れている(2-5).
脱脂乳をイオン交換膜電気透析法で脱塩すると,カゼ
インミセルはサプミセルに解離する【6)ものが増加する
ことが知られている.カゼインミセルからサプミセルの
解離現象は,脱脂乳の酸性化,透析による脱塩(7),
クエ
ン酸ナトリウム,
しゅう酸ナトリウムの脱カルシウム剤
の添加によって生じる現象【
B)
と類似している.
すなわ
ち,カゼインに結合しているカルシウムやリンをいずれ
かの方法で除去すると,
ミセルはサプミセルに解離す
る.このことは,カゼインのミセル形成に,塩類の存在
が重要な役割を果たすことを示唆している.
本報告では,脱脂乳をイオン交換膜電気透析法で脱塩
(
17
)
1214
昭他
Nii
onJ
ge
agaku
Kaishi
する過程の,存在形態別カルシウム・リンに着目し,脱
カルシウム・リン量と,
カゼイソミセルの解離の関係に
ついて明らかにした結果を報告する,
in
Milk
total
mineral
試料および実験方法
I.
イオン交換膜電気透析
生乳からクリームを分
離し,70
CC
15
分間殺菌した脱脂乳160
kg
をイオン交
換膜電気透析装置(徳山曹達
TS-24
型)を用い,温度
7.
3-.-10.
0℃で約10時間脱塩した.脱脂乳の組成は,
脂肪0.
16%,蛋白質2.
92%,乳糖4.51%,灰分0.69
%,全固形8.28%であった.イオン交換膜は膜面積
0.
24
m2/sheet
のネオセプタ
C
66-5
T
と,
ACH-45
T
40対用いた.
2.
成分分析法
水分,蛋白質,灰分の分析は乳製
品試験法注解(9)に従い実施した.ただし,蛋白質のうち
力ゼイン態窒素は,脱脂乳を10%酢酸と
lN
酢酸ナト
リウム混合液でカゼインを沈殿させ,その上澄液をケル
ダール法により求め,この値と脱脂乳中の全窒素の値の
差から算出した,無機成分の
Na,
K,
Ca,
Mg
は原子吸
光法(島津
AA-650)
により,
P
はモリブデン酸による
此色法で,
Cl
は硝酸銀法で,
P04
はイオンク
n
マトグラ
フィー
(ダイオネックス
20001)
により求めた.
3.
形態別
Ca,
P
の定量法
乳中の
Ca,
P
の存在
形態1こついては,イオン状,
コロイ
ド状,カゼイン結合
型に分けている報告(10・ェ
D
がある‘
しかし,コロイド状と
カゼイン結合型の区別が明らかでない.本報告では,塩
が存在すると考えられる三形態すなわち,カゼイン結合
型,コロイド状およびイオン状での平衡状態を変えない
で測定する方法(12)のなかから限外濾過と遠心分離法を
組み合わせ,
Fig.
1
のように,110,000
xg2
時間超遠心
分離し,カゼインとともに沈降する画分をカゼイン結合
型とし,その上澄液を分画分子量20,
000の限外濾過膜
(
AM
ON
社製フミコン
M-20)
で加圧限外濾過し,そ
の透過液に含まれる画分をイオン状,非透過性画分をコ
ロイド状とした.
結合型カルツウム,
リソは沈降カゼイ・ン105
g
当りの
mol
数で表し,
Ca/P
mol
比を算出した.
4.
濁度
小此木ら‘0の方法に準じ脱脂乳0.
5
ml
を脱イオン水で12
m1
に希釈し,10
mm
の石英ガラス
七ルで波長610
nm,
スリット2
mm
の条件で分光光度
計(日立220
A
型)
を用い吸光度を測定し濁度とした.
5‘
電子顕微鏡観察
脱脂乳
lml
と,
カコジレー
Permeate
Retentates
ionic
mineral
colloidal
mineral
Fig.
1.
Fractionation
Process
of
Mineral
Corn
ponent
in
Skim
Milk.
ト緩衝液で脱脂乳の
pH
に調整した2.45%グルタール
アルデヒド
lml
を混合し,2-12時間前固定をした.後
固定は前固定と同じ
pH
の緩衝液で2%四酸化オスミ
ウム溶液をつくり,これを前固定の終了した試料に等量
混合し,
2時間固定した.その後,脱イオン水で5000
倍に脱脂乳を希釈し,内径約1
mm
のガラス管を用い,
あらかじめカーボン支持膜を張ったメッシュ上1こ,一滴
載せ室温で乾燥した.これに白金を角度30度からシャ
ドウイング後透過電子顕微鏡(日立
HU-12A
型)
で観
察した.
6.
超遠心分離
分離用超遠心機(日立
ACP85
H
型)
でアングルローター
SRP
70
AT
を用い110,
900
×
g
で40分間遠心分離し,上澄液量を測定後サンプリ
ングした.
分画遠心(8)は15,600
xg,
62,
400xg
および110,
900
xg
の条件で順次40分間遠
心分離した.そのときに沈殿したカゼインペレットの重
量を測定し,遠心操作を繰り返し行った.遠心操作は温
度15℃で行った.
7.
表面疎水性指標
脱脂乳中の蛋白質の表面疎水
性を
Kato128)
らの方法を改良して測定した.すなわち,
脱脂乳と
pH7.4,
0.01M
イミダゾール緩衝液の等量混
合液2
m1
l,
3.6X1013M
シスパリナリン酸ェタノー
ル溶液10
pl
を加えた.シスパリナリン酸・試料混合溶
液の相対的蛍光強度は,325
nrn
で励起し蛍光分光光度
Centrifuged
:
llO,000xg,
2h
~
~
Pp
L
Sup.
bo
mineral
I
Ultrafiltration
:
cut
off
molecular
we
I
gilt;
20000
~
27,700xg,
43,300xg,
(18
)
2
4
6
Time
(h)
100
I
B
10
120
20
0
Vol.
65,
No.8,
1991)
イオン交換膜電気透析法による脱脂乳脱塩過程のカゼインミセルの形態変化
1215
計(日立650-10
St
型)
を用い420
nm
で測定した.相
討的蛍光強度は,シスパリナリン酸溶液10
pl
を含まな
い試料を前記イミダゾール緩衝液に加えたときの値をプ
ラソクとして
1・0
とし算出した.〔蛍光強度ノ蛋白質濃
度〕は蛋白質濃度に対する蛍光強度のプロットから求め
た.
1.
脱塩過程のミネラル組成の変化
脱塩中の各塩の脱塩率の変化を
Fig.
2
に示した.脱
塩初期に1価イオンの
q,K
が脱塩され,それに次い
Na,
Mg,
Ca,
P
が脱塩された,10時間後の最終脱
塩率は
K,
Cl
が100%で
Na
94%,
Ca
90%,
および
Mg
84%,
P
は73%で最も低い脱塩率であった(
Fig.
一2).
このような各塩の脱塩挙動は
Hiraoka
ら(2)の脱脂
乳,小此木ら〔4)の還元脱脂乳の結果と同様であった.
2,
形態別カルシウム,
リン量
イオン状,コロイド状およびカゼイン結合型に分画し
たカルりノウムとリソ量の結果を
Fig.
3
に示した.
カルツウムの脱塩過程で,イオン状は脱塩初期に多く
-存在するが,カルシウム脱塩率50%以後ではかなり減
―少し,最終的にはほぼゼロになったー結合型はカルシウ
ム脱塩率80%まで減少しほとんどゼロとなり,その後
-増加する傾向を示した(
Fig.
3
A).
リンの揚合はカルシウムと似た経時変化であるがカル
Fig.
2.
Changes
in
Relative
Demineralizing
Ratio
during
Demineralization
Process
of
Each
Mineral.
ロ,
Cl
(initial
con-
tent:
107
mg/100
g)
;
, K
(158
mg/100
g)
;
0,
Na
(45
mg/100
g);●
,
Ca
(121
mg/100
g)
;■,
P
(90
mg/100
g);
A,
Mg
(11
mg/100
g).
A
0
20
40
60
80
100
B
a
C
0
20
40
60
80
100
Ca
demineralizing
ratio
(%)
Fig.3.
Relation
between
Classified
Ca
(A),
P
(B)
Content
and
Ca
Demineralizing
Ratio.
a
zone:
ionic
phase,
a'
zone:
P04
content
of
ionic
phase,
b
zone:
colloidal
phase,
c
zone:
Ca,
P
binding
casein.
シウムに比ベイオン状の比率がつねに高い(
Fig.
3
助‘
とのイオン状は大部分がリン酸基
P045-
であった.結
合型リソはカルツウム脱塩率80%
で最小値となり,最
終90万ではやや増加した.
リンの脱塩過程はカルシウ
ムの場合と同様の挙動を示した.
カゼイン結合型のカルシウムとリンの
mol
量を
Fig.
4
に示した.カゼイン結合型カルシウムは,脱塩初期か
らほぼ直線的に減少しカルシウム脱塩率80%で最小値
となり,90%でふたたび増加した.また,リンの揚合は
カルツウム脱塩率50%からカルシウムと同じ傾向にな
り,90%て汰幅に増加した.
Fig.
5
にカゼイン結合型
Ca/P
mol
比を示した.カゼイン結合型
Ca/P
比は当初
1.38であった.カゼイン結合型
Ca/P
mol
比は,脱塩の
進行に伴って徐々に減少し,カルシウム脱塩率50%か
(
19
)
0
Fig.4.
20
l
I
0
20
40
60
80
100
Ca
cfemtneralizing
ratio
(%)
Effect
of
Ca
Demineralizing
Ratio
on
the
Content
of
Ca
and
P
Bound
to
Casein.
0,
Ca
;
ロ,
P.
t
03
05
1216
昭他
0
20
40
60
80
100
Ca
demineralizing
ratio
(%)
Fig.5.
Effect
of
Ca
Demineralization
on
Ca/P
Ratio.
,
total
Ca/P;
0,
Ca/P
bound
to
casein.
ら70%の間では,ほぼ1になった.カルツウム脱塩率
90%ではカゼインに結合するカルシウムが少なく,
ンが増加するためその比は急激に減少した.一方,全
Ca/P
比率はカルシウム脱塩率70%まではほぼ1で,あ
まり変化しないが,これを過ぎると小さくなる.カルり/
ウム脱塩率50%以後は結合型とほぼ同じ値であった.
3.
脱塩過程のカゼインミセルの形態変化
1)
濁度による測定
脱塩率と濁度の関係(
Fig.
6)
は,カルシウム脱塩率が増加するに従って濁度はほぼ直
線的に減少するが,乳白色は最終脱塩脱脂乳でも消えな
かった,また,濁度は脱塩率80%で最小値を示し,そ
れを超えるとやや増加した.
これは
Fig.
3
の結合型の
力ルシウム,
リン量の経時変化と同じ傾向であった.
一2)
電子顕微鏡による測定
一滴の脱脂乳をガラス
CNi
onN
eikagaku
Kais
I
0
40
60
80
Ca
demineralizing
ratio
(%)
Fig.6.
Relation
between
Turbidity
in
Skim
Milk
and
Ca
Demineralizing
Ratio.
板の上で乾燥すると,その跡は肉眼ではリソグ状に見え
る.
Fig.
7
は固定・希釈した試料一滴を乾燥し,シャド
ウイング法を用い電子顕微鏡で観察したものである‘
Fig.
7a
の黒い帯状部は,電子線が全く透過しない部分
で,肉眼でリング状に見える部分に相当する‘帯状部の
上部は,肉眼でリング状に見える部分の内側に相当す
る.ここには,カゼイン粒子が分散していた.
Fig.
7
b
は帯状部の外郭を拡大したところである,帯状部はカゼ
インが厚く堆積しており,大きなカゼインミセルの存在
はわかるが,サプミセルのような小粒子は堆積部分に埋
没し,その大きさは識別できない.
Fig.
7
c
は帯状部か
ら外側に離れた,液滴とカーポン支持膜の接触面の最外
郭部である.最外郭部は,小さなサブミセルが直線状に
配列し,その粒子の大きさは8
nm
であった,最外郭部
の内側は,
ミセル状の大きな粒子は存在せず,サブミセ
ルだけが存在した‘
このような観察結果から,
Fig.
8
に固定・希釈後の脱
脂乳一滴を乾燥した後のカゼイン粒子の分散状態を模式
的に示した.
このように,カゼイン粒子は不均一に分布しているの
で,電子顕微鏡写真から正確な平均値は得られない可能
性がある.
しかし,カゼイン粒子の最大値,最小値はこ
の観察方法で,かなり正確に測定できる.ここではカゼ
イン粒子の最大・最小値に着目した.
脱塩過程の脱脂乳中のカゼイ
ンミセルの形態変化を
Fig
・9に示した・なお,
a'-e
Fig.
8
のリングの内側
で,
f
は外側の部位を観察した.脱塩されるに従って大
きなミセルは減少した.最大ミセル直径に着目すると,
初期(
a)
は280
nm
で,
Ca
脱塩率60%
(
d)
では
60
nm
に減少した・
しかし,脱塩率80%の(
e)
では,
100
(
20
)
Vol
・65,
No.8,
1991
イオン交換膜電気透析法による脱脂乳脱塩過程のカゼインミセルの形態変化
1217
’抑
,
,J
遮ジ「欝響響鷲「嫩鷲難一
gl
繊難:1「繊難ミ警響加。准墜夢
Observation
of
the
Ring
Consisting
of
the
Dispersion
of
Casein
Particles
in
a
Skim
Milk
Drop
of
the
After
Drying.
a)
Black
part
:
ring,
above
the
black
part
:
inside
part
of
ring,
b)
outside
part
of
the
ring,
c)
the
peri?hery
of
the
contact
surface
between
the
drop
and
carbon
fiLrn.-
Fig.
7.
Initial
drop
\
I
!云
詳,....,..」●”息.,纏夢
I
.
Carbon
film
/
、、.、..●、、●●●●●、””●、、●、、、、、、●、、’、、、、、、、“”、、●、、、、、、、、、、、””’、、、
Fig.
8.
Illustration
of
the
Dispersion
of
Casein
Particles
in
a
Dried
Drop
of
Skim
Milk.
すべてのミセルがサブミセルに解離しているのではな
く,100
nm
程度の粒子が多数存在した.
リングの外側
で観察した
I
では
50
nm
以下のサプミセル粒子だけが
存在した.
Fig.
10
にカルシウム脱塩率50%と70%の遠心上澄
液の加圧限外濾過の非透過性画分,すなわち,
コロイド
状カルシウム,
ンの存在する画分の観察結果を示し
た.
この画分には
50
nm
以下のサブミセル粒子だけが
存在した.
3)
超遠心分離による測定
カゼインミセルの崩壊
過程の変化を全体的にとらえるために,重力加速度を変
えた遠心分離を繰り返し行い,その沈殿したカゼインペ
レットの重量を逐次測定した.
Fig.
11
に各脱塩脱脂乳
の重力加速度と沈降したペレットの乳に対する重量%を
示した.脱塩初期から
35%脱塩率までは,30,
000
x
g
の遠心分離で大部分のカゼインが沈降した.この程度の
脱塩ではミセルは変化していないと考える.脱塩率が高
くなるに従って,沈降するカゼイソ量は減少し,多数の
ミセルがサブミセルに解離していることを示唆した‘
各脱塩脱脂乳を110,000
Xg
で遠心したときのカゼイ
ンの沈降量を初期乳の沈降量を基準として指数化し,カ
ルシウム脱塩率に対してプロットしたのが
Fig.
12
であ
る.脱塩に伴って沈降量は減少し,
ミセルがサブミセル
に解離していることを示した.カルシウム脱塩率77%
では約35%
が沈降し,
ミセルのすべてがサブミセルにー
解離していないことを示した.この結果は濁度,電子顕
微鏡観察の結果と一致した.
カルシウム脱塩率77%以上で沈降したカゼインの性
質を知るために,
カルシウム脱塩率77%脱脂乳に,生
脱脂乳の乳濁色が消えると同じ量の
EDTA
を添加し
た.
しかし,高脱塩脱脂乳の場合には通常脱脂乳のよう
な乳濁色の消失はみられなかった,
4)
表面疎水性
蛋白粒子表面の疎水性を,
シスパ
リナりン酸による蛍光強度で測定した結果を
Fig.
13
示した‘表面疎水性はカルシウム脱塩率70%
までは大
きな変化はないが,80%で急激に上昇し90%ではやや
下降した.80%にピークを持つことは
Fig.
3,
4,
6
結果と逆の傾向である.
乳中の無機成分は,カゼイン結合状,
コロイド状,イ
(
21
)
'
1218
昭他
Ni
on
Nageikagaku
Kaishi
」1、
夢絮り辱
m
零’'
f
''
4
S
0
400
nm
t
Fig.9.
Electron
Micrographs
of
Casein
Micelles
in
Demineralization
of
Skim
Milk,
a)
Skim
milk
before
demineralizing,
b)
skim
milk
of
20%
demineralizing
of
Ca,
c)
40%
demi.netaIizing
of'
Ca,
d)
60%
demi-
neralizi.
g
-of
Ca,
eY'80%
demineralizing
of
Ca,
f)
observation
of
(e)
sample
out
of
ring
on
the
Fig.
9.
i
繁一‘『警驚鴛督離ー‘
I
-t
'"
'!
’、
舞己
釁舞欝
耀
z.
''
,
'
ly
#l,
Fig.
10.
Electron
Micrographs
of
UF
Retentate
of
Supernatant
by
Centrifugal
1.
lxlo5xg,
a)
Skim
milk
of
50%
demineralizing
of
Ca,
b)
skim
milk
of
70%
demineralizing
of
Ca.
’帯
(
22
)
10
9
8
3
\
2
10
l
Centrifugal
acceleration
0(1d4G)
Fig.
11.
Precipitation
Ratio
Plotted
against
Cen-
trifugal
xg.
Demineralizing
ratio
of
Ca:
L, 0%;
口,
23.7%;
&
43.2%;◇,
44.9%;●,
54.2%;■,
67.8%;
A,
70.8
%;.,
77.1%.
I
100
I
0
20
40
60
80
Ca
demineralizing
ratio
(%)
Fig.
12.
Relation
between
Centrifugal
1.
1><
lo5xg
and
Precipitation
Ratio.
0
100
Vol.
65,
No.8,
1991)
イオン交換膜電気透析法による脱脂乳脱塩過程のカゼインミセルの形態変化
1219
オン状の形態で存在すると考えられている.カゼインミ
セル中にも無機成分は6%含まれ
t14),
そのうち,カルシ
ウムとリンはコロイ
ド状リン酸カルシウム
CCP)
と呼
ぱれ,カゼインとの複合体を形成している.
CCP
pH
の低下〔15),透析によってカゼインから容易に解離する.
CCP
とカゼインの結合様式は,
CCP
は正に,力ゼイン
は負に帯電する静電的結合である(15).カゼイソに結合す
CCP
の定量は,カゼインに一部のカルシウムが直接
結合することと,その部分を独立に測定できないことか
ら困難である(16).このようなことから,各種の形態で存
在する無機成分量の定量は,従来明瞭に測定されていな
かった‘本実験では脱塩過程における,カゼイン結合
相,コロイド相,溶解相間で無機成分の平衡状態を変え
ずに,各相に存在するカルシウム,
リソを定量すること
を試みた
Fig.
1).
コロイド状画分中には,サプミセル
が独立した粒子として存在していた(
Fig.
10).
このこ
とは,
コロイド状画分の無機成分は,解離したサプミセ
ルに結合していると考える.もし,
CCP
がサブミセルと
1
0
20
40
60
80
100
Ca
demineralizing
ratio
(%)
Relation
between
Surface
Hydropho一
bisity
Index
and
Ca
Demineralizing
Ratio.
結合せずに,独立した1個のコロイド粒子として存在す
るのであれぱ,
CCP
の分子量,および
Betts
Pos-
ner(17)
x
線回折の結果から推定した大きさ0.
9
nm
ら考えて
CCP
は,イオン状とコロイド状に分画すると
きに,分画分子量20,
000の限外濾過膜を通過するはず
である.
しかし,実際にはこの膜を通過していない,分
画分子量20,
000の膜を通過しないほどの大きな物質
は,脱脂乳遠心上澄液中ではサプミセルしか考えられな
い.このことから,
コロイド状画分中の
CCP
はサプミ
セルに結合していると考える.カゼインに結合している
という点で,コロイド状画分の無機成分の存在状態は,
結合するカゼイソの大きさが異なるだけで,カゼイソ結
合型と類似であるといえる.
次に,脱塩中にミ・セルが解離する過程を考える.脱脂
乳脱塩挙動はカゼイン結合型
Ca/P
比に着目すると,3
(
23
)
Stage
Time
(h)
0-4
4--.6
6-.40
80
50-35
<35
ら再
mine
lizing
or
s)lm
mILe(万J
Precipiraze
レ'
a
0'-50
50-80
80-400
Casein
binding
Ca,
P
rnol
ratio
I
Ca/P=1.
4-.1.
0
]I
Ca/Pr1
1ff
Ca/P<l
1220
昭他
Ni
on
Nogeikagaku
Kaishi
Table
L
Demineralizing
Process
of
Skim
Milk
Table
II.
Demineralizing
Process
and
Conformational
Change
of
Casein
Micelle
Demineralizing
Process
Conformational
Change
of
Casein
Micelle
I'
Ionized
mineral
in
skim
milk
was
demineralized.
ii.
The
CCP
bound
to
micelles
in
co1loi
dal
phase
is
dissociated
in
ionized
state
and
then
demineralized.
III.
Ca
of
Ser-P04-Ca
bound
to
casein
is
dissociated
and
demineralized.
After
demineralization
of
ionized
niineraL
CCP
was
dissociated.
The
dissociation
of
submicelle
from
micelle
is
caused
by
the
decrease
of
CCP
bridge.
The
submicelle
dissociated
from
micelle
is
in
colloidal
phase.
The
mineral
bound
to
precipitated
casein
are
P04-Ca,
and
the
ratio
Ca/P
is
one.
Only
P04
bound
to
serine
remains
in
casein.
段階に分けて整理できる,各段階の脱脂乳中の無機成分
の脱塩の挙動とそれに伴う変化の推論をそれぞれ
Table
I,
II
i
示す‘
Table
II
I
の段階は乳中に初めからイオン状で存在
した無機成分が主に脱塩される,
Ca
の場合,初期脱脂
乳中のイオン状は,全
Ca
の約30%である.これが脱
塩される時間は,
Fig.
2
から約2時間である.乳中の無
機成分はイオン状,コロイド状および結合型が平衡状態
にある(18〉ので,イオン状が脱塩されると,この平衡を保
つように
CCP
がミセルから解離しイオン状になり,逐
次脱塩されると考える.
次に
Jr
の段階は,カゼイン結合型
Ca/P
比が約1であ
り,カゼイン結合型カルシウム,
リン量の減少が著しく
(
Fig.
4),
沈降するカゼイン量も減少する.
Ca/P
比が1
であることを
Schmidt
のモデル(19)に当てはめて考える
と,すべての
Ca6(P04)9
がミセルから解離し,
Serine
、以下
Se
りー
P04-Ca
のリン酸とカルシウムだけが力ゼ
f
ンに結合している状態と考える.
一方,この段階のコロイド相中には多数のサプミセル
が存在し
Fig.
10),
カルシウム,
リン含量も増加する
(
Fig.
3).
これは,サプミ七ル間を結合しているリ
ン酸
カルシウム架橋の主体である
CCP
が,
Ser-P04-Ca
cCP
Ca-P04-Ser
の・部分のー方が解離し,サブミセ
ル間の架橋がはずれる.とのような現象が複数の位置で
発生した時点でサブミセルは,
ミセルから解離するであ
ろう
I
この解離は,サブミセル1個に対し複数個存在す
るリン酸カルシウム架橋が,どの程度はずれたところで
生じるか不明である,
ミセル1個からのサブミセルの解離は,
ミセルの大き
さの変化から考えて,一度に発生するのではなく,
ミセ
ル表面から徐々に進行すると考える.サブミセルがミセ
ルから解離するとき
CCP
は,サブミセルに結合した状
態でミセルから解離し,
コロイド相で徐々にイオン状に
解離するものと考える.この解離に要する時間は2時間
でこの間沈降するカゼインに結合する
Ca/P
比は変化し
ない,コロイド相の
CCP
の解離・脱塩が完了すると,
次の皿の段階に移行する.
~の段階でカルシウムの脱塩は,さらに進行するが,
リンの脱塩率は,73%
でほぼ平衡に達する.
このこと
は,~段階で残ったカゼイン結合型の
Ser-P04-Ca
のカ
ルシウムだけが脱塩され,
Ser
に結合する有機リンだけ
が残る‘そのため,
Ca/P
比は急激に低下する.
本実験のカゼイン結合型カルシウム,
リンの比は脱塩
前1.38であった,乳中に存在するカルシウムとリンの
比率に関しては過去にいくつかの報告がある.
MorrIn
らは生乳の
CCP
Ca/P
EDTA
法で1.
50,
pH
4.
9
法で1.
56であることを示した.小野ら(
B
〉は分画遠心に
よりミセルの大きさを分けて,それに結合するカルり/ウ
ム,リンの量を測定した・15,000
xg
で沈降する大きな
(
l2onni)
ミセルに結合するカルシウム,
リンはおのお
(
24
)
v0l
・65,
Ni
ェ8,
1991〕
イオソ交換膜電気透析法による脱脂乳脱塩過程のカゼインミセルの形態変化
1221
'-の38,
22
mg/casejn
でこれから算出した
Ca/P
mol
比は1・37であった.大きなミセルの
mol
比1.37は本
実験の初期値とほぼ同じである,
Holt)20
〕は乳中の
CCP
のカルシウムとリ
ンの比率を
EDTA
で分析した結果
ca/P04
1・61士0.04
で歯のェナメル質の値と類似で
あることを示した,
このように,多くの研究者によっ
て報告されているカゼインに結合するコロイド状リン酸
功ルツウムの
Ca/P
比は
1.37から1.6である.
とのよちな
CCP
架橋がミセル内部のどのよらな位置
肥存在するか,直接的な証明は生乳ではされていない,
しかし,
Knoop(2')
らは,
人工ミセルの超薄切片を無染
色で観察し,
ミセル内部のサブミセル粒子間に高弾性散
こ乱コントラスト部分があり,
これがカルシウム,
リンに
よるものであると述ぺている.生乳の場合でもサブミセ
ル間にリソ酸カルツウムプリッジとして存在しているの
’であろう,
Fig.3,
4,
6
i
こおいてカルツウム脱塩率80%の部分
1こ山や谷がみられる.これらの現象はすべて1つのとと
に由来していると考える.つまり,脱塩が進行すると,
カゼイソミセルの大きさは小さくなり,サプミセルに解
離するものが増加する,
L
かし,カルツウム脱塩率が
'90%になると,一度解離したサプミセルがふたたび疑
集していると考える.再凝集すると,カゼイン粒子は大
きくなり,濁度は再上昇する.また,カゼイン沈降量の
増加によりカゼイン結合型
Ca,
P
含量も増加する.
の凝集する現象を疎水性指標値でみると,
Ca
脱塩率80
%の疎水性指標値は増加し,90%でふたたび低下する
(
Fig.
13).
これは,脱塩の過程で,
ミセル内部に存在し
ていた表面が疎水性のサブミセルが,多数解離している
ことを示唆している.このようたサブミセルは,脱脂乳
中で安定なコロイドとして長時間存在できず
疎水性部
分どうしを接合するように凝集する.その結果,表面疎
水性指標は,疎水性部分が新たにできた凝集体の内部に
位置するために,ふたたび減少すると考える.
との再凝集カゼイン粒子間に働く作用は,90%脱塩
脱脂乳に
EDTA
を加えても透明にならずに乳白色のま
まであったことから考えて,残存する少量のリン酸やカ
ルツウムによるプリッジによる結合ではなく,疎水性相
互作用であろう.
このようなカゼイン微粒子が凝集する現象は他の食品
査白質のゲル化機構(22),とくに加熟によるゲル形成過程
でみられる可溶性凝集体の網目構造への移行と類似のも
のであると考える.たとえば,大豆蛋白質(23),卵白アル
ブミン〔24)においての可溶性凝集体の生成と網目構造へ
の移行や,卵白リゾチーム(25)のジスルフィ
ド結合の一部
が分子表面に露出し,それとともに加熱ゲル形成性が著
しく増加するという報告がある.以上のように,蛋白質
の凝集およびゲル形成性には,疎水性相互作用が重要な
役割を果たしていると考える.
イオン交換膜電気透析法を用いて脱脂乳の無機成分を
脱塩した.カゼイソミセルは脱塩の過程でサブミセルに
解離した.その解離過程を無機成分量とカゼインミセル
の大きさの変化について考察した.脱塩中の無機成分の
うちとくにカルツウムとリンは,イオン状,
コロイド状
およびカゼイン結合型に分けで測定した.カゼインミセ
ルの形態変化は遠心分離,濁度および電子顕微鏡で測定
した.
脱脂乳の脱塩過程は,次の三段階に分けて考えること
ができた.脱塩の各段階を,カルシウム脱塩率で表わす
と,0~50%,
50-.80%および80%以上で,カゼイソ
結合型
Ca/P
mol
比で表わすと,
おのおの1.
38-
1.0,
L0
および1.0未満である.脱塩の第一段階は乳
中にイオン状で存在していた無機成分が脱塩される.第
二段階は,カゼインに結合していた無機成分が解離し,
それに伴いミセルからサプミセルが解離する.この段階
はミセルの大きさが減少
L,
コロイド相のカルシウム,
リンが増加する.第三段階は,わずかに残ったカゼイン
に結合するカルシウムは脱塩されるが,有機リンは脱塩
されずに残り,
CaIP
比は1.0未満になる.
カゼインミセルの大きさは,脱塩に伴って徐々に減少
し濁度測定の結果,カルシウム脱塩率80%で最小値に
なった.遠心分離で沈降するカゼインに結合するカル
s
ウム量は,脱塩初期からほぼ直線的に減少しカルシウム
脱塩率80%で最小となり,90%でふたたび増加した.
また,表面疎水性はカルシウム脱塩率80%で最大値に
なった.
このことはカゼインミセルがサプミセルに解離
し,
ミセル内部に存在する表面が疎水性のサプミセル
が,多数解離していることが示唆された‘疎水性のサブ
ミセルどうしが凝集するために,力ルツウム脱塩率90
%でふたたび大きな粒子が増加すると考えた.
本研究の実施,発表について許可をいただき,推進の
(
25
)
1222
昭他
指導,激励をいただいた雪印乳業株式会社専務取締役研
究本部長,十河幸夫博士に深く感謝申し上げます,ま
た,本研究を実施するにあたり,脱脂乳の成分分析をし
ていただいた分析部矢吹智宜氏,菊地
聡氏に厚く感謝
いたします.
小久見善八:表面,23,
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