Zur Nitrat- und Nitritanalytik in Futtermitteln 3. Mitt. Spektrophotometrische Bestimmung von Nitrat und Nitrit mit Sulfanilsäure/1-Naphthylamin sowie Nitrit mit Resorcin/Zirkonium (IV)-oxidchlorid


Zimmermann, K.; Lengerken, J.V.

Molecular Nutrition & Food Research 23(9-10): 929-934

1979


Der Nitratgehalt von Futtermitteln ist über Azofarbstoffkupplung nach Reduktion des Nitrats durch in der Probelösung erzeugtes aktives Cadmium bestimmbar.Ein einfacher Weg zur Nitritanalytik ergibt sich durch colorimetrische Auswertung eines aus Nitrit, Resorcin und Zirkonium(IV)-oxidchlorid gebildeten gefärbten Chelatkomplexes.

Die
Nahrung
23,
9/10,
1979,
929-934
Zentralstelle
für
Futtermittelprüfung
und
Fütterung
Halle-Lettin,
DDR
(Direktor:
Dr.
G.
KNAPE)
Zur
Nitrat-
und
Nitritanalytik
in
Futtermitteln
3.
Mitt.
Spektrophotometrische
Bestimmung
von
Nitrat
und
Nitrit
mit
Sulfanilsäure/l-Naphthylamin
sowie
Nitrit
mit
Resorcin/Zirkonium
(IV)-oxidchlorid
i
K.
ZIMMERMANN
und
J.
V.
LENGERKEN
Der
Nitratgehalt
von
Futtermitteln
ist
über
Azofarbstoffkupplung
nach
Reduktion
des
Nitrats
durch
in
der
Probelösung
erzeugtes
aktives
Cadmium
bestimmbar.
Ein
einfacher
Weg
zur
Nitritanalytik
ergibt
sich
durch
colorimetrische
Auswertung
eines
aus
Nitrit,
Re-
sorcin
und
Zirkonium(IV)-oxidchlorid
gebildeten
gefärbten
Chelatkomplexes.
In
Weiterführung
unserer
Arbeiten
[1,
2]
war
es
Anliegen
der
hier
vorgestellten
Versuche,
einen
geeigneten
Analysengang
zur
Gehaltsbestimmung
von
Nitrat
in
Futtermitteln
über
Azofarbstoffe
festzulegen,
wobei
besonderer
Wert
auf
eine
unkomplizierte
Reduktion
des
Nitrats
zu
Nitrit
gelegt
wurde.
Bekannte
Verfahren,
bei
denen
das
zur
Diazotierung
be-
nötige
Nitrit
durch
Umsetzung
von
Nitrat
mit
aktivem
Cadmium
in
Reduktorsäulen
ge-
bildet
wird
[3-9],
sind
unseres
Wissens
in
der
DDR
zur
Analytik
in
Futtermitteln
in
gerin-
gerem
Umfang
als
das
o-Kresol-
bzw.
Xylenolverfahren
gebräuchlich.
Demgegenüber
sollten
diskontinuierliche
Methoden
(Erzeugung
von
Cadmiumschwamm
in
der
Probe-
lösung)
[10]
unter
der
Bedingung
einer
quantitativen
Reduktion
des
Nitrats
für
Routine-
zwecke
vorteilhafter
einzusetzen
sein.
Schließlich
galt
es,
die
auf
gleichem
Mechanismus
unter
Auslassung
des
Reduktions-
schrittes
basierende
Nitritbestimmung
in
Pflanzenextrakten
Ergebnissen
einer
bisher
nicht
für
Futtermittel
bearbeiteten
komplexchemischen
Reaktion
der
nitrithaltigen
Probelösungen
mit
Resorcin/Zirkonium(IV)-oxidchlorid-Reagenz
[11]
gegenüberzustellen
und
ein
empfind-
liches
sowie
haltbares
Nitrit-Testpapier
zu
entwickeln.
Methodik
Die
photometrischen
Messungen
erfolgten
an
einem
EPPENDoRF-Substratmeßplatz
und
einem
Spektral-
photometer
„VSU
2-P"
(VEB
Carl
ZEISS,
Jena);
Analysen
zur
Referenzmethode
wurden
wie
bereits
beschrie-
ben
[1]
ausgeführt.
Es
fanden
ausschließlich
Chemikalien
von
p.
A.-Qualität
Anwendung.
2.
Mitt.
Nahrung
23,
523
(1979)
930
ZIMMERMANN/LENGERKEN
Reagenzien
zur
Azofarbstoffkupplung
Zinkpulver,
Ammoniaklösung
(25
%ig)
Cadmiumacetatlösung:
5,0
g
Cadmiumacetat-2-hydrat
und
1
ml
Eisessig
werden
mit
H
2
0
zu
100
ml
auf-
gefüllt.
GRIEss-Reagenz
I:
3,0
g
Sulfanilsäure
und
100
ml
Eisessig
werden
mit
H
2
O
zu
500
ml
aufgefüllt.
QuEss-Reagenz
II
:0,15
g
1-Napthtylamin
und
100
ml
Eisessig
werden
mit
H
2
O
zu
500
ml
aufgefüllt.
Zur
Herstellung
des
Nitrit-Testpapiers
enthalten
die
Reagenzien
1
und
II
zusätzlich
je
100,0
g
Weinsäure.
Reagenzien
zur
Zirkonium-Chelatkomplexbildung
Reagenz
A:
1,0
g
Resorcin,
1,1
g
Zirkonium-(IV)-oxidchlorid-8-hydrat
und
7,5
ml
konzentrierte
Salzsäure
werden
mit
H
2
O
zu
500
ml
aufgefüllt.
Reagenz
B:
1,5
g
Natriumacetat-3-hydrat
und
1,0
g
Natriumsulfat
werden
mit
H
2
O
zu
500
ml
aufgefüllt.
Vorschrift
zur
Nitrat/Nitritbestimmung
mit
GmEss
-
Reagenzien
Nitrat
2
ml
der
wäßrigen
Pflanzenextrakte
[1]
werden
im
50
ml-Maßkolben
mit
5
ml
H
2
O,
2
ml
Ammoniak-
lösung
und
0,5
g
Zinkstaub
versetzt.
Die
Mischung
wird
kurz
geschüttelt
und
nach
Zugabe
von
1
ml
Cad-
miumacetatlösung
5
bis
10
min
sich
selbst
überlassen,
mit
H
2
O
aufgefüllt
und
filtriert.
2
ml
des
Filtrats
werden
mit
5
ml
GRIEss-Gemisch
(vor
der
Bestimmung
aus
gleichen
Teilen
der
Reagenzien
I
und
II
hergestellt)
ver-
setzt
und
die
Farbintensität
der
Lösung
nach
15
min
gegen
einen
Blindwert
(analog
ohne
Pflanzenextrakt
erhalten)
in
einer
1
cm-Küvette
bei
530
nm
gemessen.
Nitrit
Die
sorgfältig
zerkleinerte
frische
Futtermittelprobe
wird
im
Mixgerät
mit
H
2
O
extrahiert,
ein
aliquoter
Teil
der
Probelösung
mit
Giums-Reagenzien
auf
50
ml
aufgefüllt
und
die
Färbung
wie
oben
gemessen.
Nitrit-Testpapier
Auf
je
einem
Ende
der
Filterpapierstreifen
werden
die
mit
Weinsäure
hergestellten
GRIEss-Lösungen
ge-
trennt
aufgetragen
und
die
Streifen
getrocknet.
Zum
qualitativen
Test
werden
beide
Substanzflecken
in
Essig-
säure
und
dann
kurz
in
die
Probelösung
getaucht.
Unter
Kontakt
der
Nachweiszonen
miteinander
entwickelt
sich
bei
Anwesenheit
von
Nitrit
in
15-30
min
die
gehaltsabhängig
kräftige
bis
blasse
vom
Azofarbstoff
her-
vorgerufene
Rotfärbung.
Vorschrift
zur
Nitritbestimmung
mit
Resorcin/ZrOCl
2
Ein
aliquoter
Teil
des
Futtermittelextrakts
wird
im
50
ml-Maßkolben
mit
einer
im
Verhältnis
1:1
her-
gestellten
Mischung
der
Reagenzien
A
und
B
aufgefüllt. Die
Farbintensität
der
Lösung
wird
nach
15
min
in
einer
1
cm-Küvette
bei
347
nm
gemessen.
Als
Blindwert
dient
die
entsprechend
mit
H
2
O
zu
50
ml
aufge-
füllte
identische
Futtermittellösung
(der
Chemikalienfehler
der
Reagenzien
A
und
B ist
vernachlässigbar).
Reaktionsmechanismus
nach
GABBAY
u.
a.
[11]:
Salpetrige
Säure
reagiert
mit
Resorcin
zu
4-Nitrosoresorcin,
das
in
Lösung
mit
seinen
tautomeren
Oxim-
formen
im
Gleichgewicht
steht.
Bei
Anwesenheit
von
Zirkoniumionen
findet
Verschiebung
des
Gleichge-
wichts
zu
dem
ein
chromophores,
o-chinoides
Bindungssystem
enthaltenden
1-Hydroxybenzochinonmonoxim
statt,
gefolgt
von
schneller
Bildung
des
Zirkonium-Chelatkomplexes.
Störungen
Störungen
der
Bestimmung
durch
höhere
Phosphatanteile
in
den
Extrakten
(Ausfällung
flockigen
Zir-
koniumphosphats)
lassen
sich
durch
Zusatz
eines
Fällungsreagenzes
(10,0
g
Magnesium-chlorid-6-hydrat,
10,0
g
Ammoniumchlorid
und
5
ml
Ammoniak,
25
%ig,
zu
100
ml
mit
H
2
O
aufgefüllt)
in
schwachem
Über-
schuß,
bezogen
auf
Phosphat,
zur
Probelösung
vermeiden.
Nach
Filtration
vom
abgeschiedenen
Magnesium-
ammoniumphosphat
wird
wie
beschrieben
verfahren.
Tabelle
1
Mittelwerte
(i),
absolute
(s)
und
relative
(s
%)
Standardabweichungen
gemessener
Eichkurvenextinktionen
der
Nitrat-
und
Nitrit-
methoden
an
4
aufeinanderfolgenden
Tagen
(n
=
4)
Nitrit
Nitrat
G1UESS
Resorcin/ZrOCl
2
[itg
NO
2
-
/50
ml]
E
(g)
s
s
%
E
(x)
s
s
%
[ktg
NO
3
-
/50
ml]
E
(i)
s s
17,5
0,281
1,71
10
-3
0,61
0,465
4,27
10
-3
0,92
26,8
0,431
1,74
10
-3
1,72
20,0
0,320
1,73
10
-3
0,54
0,531
5,91
10
-3
1,11
35,7
0,561
4,97
10'
0,88
22,5
0,358
3,42
10
-3
0,95
0,598
5,80
10'
0,97
446
0,674
1,37
10
-2
2,03
Gehalt
der
Lösungen
Gehalt
der
GRIESS
Lösungen
3p
A
gu
rn
iffl
p
u
n
932
ZIMMERMANN/LENGERKEN
Hinweise
zur
Durchführung
der
Analysen
Nitritbestimmungen
sollten
in
jedem
Fall
in
Pflanzenauszügen
frischer
Materialien
ohne
Zwischenlagerung
erfolgen.
Im
Gegensatz
zu
Verfahren,
bei
denen
die
zu
untersuchenden
Stoffe
einer
Heißwasserextraktion
unterzogen
werden
[12-15],
lassen
sich
nach
unseren
Erfahrungen
beträchtliche
Verluste
bei
der
Analyse
zuvor
erwärmter
Nitritlösungen
nachweisen
(vgl.
auch
[161).
Die
Extrakte
werden
unter
Verwendung
von
dest.
Wasser
hergestellt;
falls
notwendig,
kann
eine
Ent-
eiweißung
mit
Kaliumhexacyanoferrat(II)/Zinksulfat
(CARREz-Klärung)
oder
anderen
üblichen
Reagenzien
vorgenommen
werden.
Diese
Substanzen
sollten
jedoch
gleichfalls
den
Eichstandards
zugesetzt
werden
[4,
9,
13].
Vor
Entfärbung
der
Auszüge
mit
Aktivkohle
[4,
14,
15]
ist
diese
auf
eventuelle
Adsorption
von
Nitrat
und
Nitrit
zu
prüfen.
In
entsprechenden
Versuchen
mit
wasserdampf-
und
zinkchloridaktivierter
Kohle
(Sorte
„EPN")
traten
bei
Filtration
einer
Lösung
von
140
µg
NO
3
-
/ml
durch
ein
kohlebedecktes
Filter
34%,
mit
Nitritstandardlösungen
(10
ag
NO
2
/ml)
71
%
Verluste
auf.
Wenig
erfolgreich
verliefen
Versuche
mit
Zucker-
kohle,
Aluminiumoxid
und
Entfärberharzen.
Demgegenüber
hat
sich
zur
colorimetrischen
Auswertung
des
hellgelben
Zirkonium-Chelatkomplexes
auch
bei
höheren
Blindwerten
von
Pflanzenextrakten
das
beschrie-
bene
Verfahren
ohne
Einschränkung
bewährt.
Filterpapier,
das
zur
Anfertigung
der
Nitrit-Teststreifen
dienen
soll,
ist
auf
Nitritfreiheit
zu
prüfen.
Trock-
nung
der
vorbereiteten,
feuchten
Testpapiere
führt
zu
keinen
Blindwerten
oder
zum
Unbrauchbarwerden
des
Papiers,
wie
dies
für
andere
Vorschriften
beobachtet
wird
[17].
Die
Streifen
zeigen
bei
der
bisher
geprüften
Lagerung
von
10
Wochen
keine
gebrauchsgeminderten
Eigenschaften
(Nitritgehalte
von
6µg
NO
2
/ml
Probelösung
waren
nach
Ablauf
dieser
Zeit
noch
sicher
identifizierbar).
Eichkurvenstabilität,
Analysenreproduzierbarkeit
und
-richtigkeit,
statistischer
Methoden-
vergleich
Zur
Ermittlung
der
Eichkurvenstabilität
wurden
KNO
2
-
und
KNO
3
-Standardlösungen
an
4
Tagen
angefärbt
und
gemessen.
Die
Kurven
verlaufen
durch
den
Achsenschnittpunkt;
Extinktionen
und
Abweichungen
der
Mittelwerte
ausgewählter
Kurvenpunkte
sind
in
Tab.
1
dargestellt.
10
Futtermittelextrakte
(Mais,
Raps,
Klee
und
Gräser)
mit
Gehalten
von
2,0-32,0
g
NO
3
-
/kg
lufttrockener
Substanz
(20-320
itg
NO
3
-
/ml
Extraktionslösung)
wurden
analog
[1]
an
4
Tagen
auf
ihren
Nitratgehalt
untersucht.
Die
errechneten
prozentualen
Abweichungen
betrugen
im
Durchschnitt
5,7
%
(Schwan-
kungsbreite
1,8-13,0%),
Ergebnisse
der
Versuche
an
nitrithaltigen
Extrakten
sind
aus
Tab.
2
ersichtlich.
Wiederfindungsversuche
mit
Zusätzen
von
12-88
µg
NO
3
-
/ml
Lösung
erbrachten
Aus-
beuten
von
durchschnittlich
96,6
%
(83,2-101,4
%),
die
Wirksamkeit
des
gewählten
Re-
Tabelle
2
Vergleich
der
nach
beiden
Methoden
ermittelten
Nitritgehalte
ausgewählter
Futtermittel-
extrakte
(10
Einfachbestimmungen),
Angaben
in
µg
NO
2
/m1
Extraktionslösung
Futtermittel
GRIESS
ResorcingrOC1
2
Gehalt
s
s
%
Gehalt
s
s
%
Mais
39,6
0,15
0,38
41,5
0,49
1,18
Ölrettich
30,6
0,25
0,82
31,5
0,35
1,12
Raps
24,8
0,14
0,56
24,6
0,30
1,22
Senf
9,7
0,12
1,24
10,3
0,22
2,14
Nitrat-
und
Nitritanalytik
3.
Mitt.
933
duktionsmittels
liegt
damit
unter
den
beschriebenen
Bedingungen
im
Bereich
getesteter
Cadmium-Agenzien
[18].
In
Recovery-Versuchen
an
50
Futtermitteln
(Mais,
Raps,
Senf,
Ölrettich,
Rübenblatt,
Hafer,
Markstammkohl,
Sommerzwischenfrüchte)
mit
Zusätzen
von
6-50
1.tg
NO
2
-
/ml
der
Extrakte
wurden
durchschnittlich
100,4
%
(84,8-103,0
%)
Ausbeute
unter
Verwendung
der
GmEss-Methode
und
99,9
%
(89,0-112,0
%)
Ausbeute
bei
Messungen
mit
Recorcin/
ZrOC1
2
-Reagenz
erreicht.
Anhand
von
Methodenvergleichen
der
Nitrat-
und
Nitritbestimmungen
mit
den
auf-
geführten
Futtermitteln
wurden
folgende
Regressionsgeraden
ermittelt:
Nitrat
Nitrit
y
=
1,005
x
0,392
y
=
0,947
x
+
0,001
r
=
0,995
r
=
0,997
n
=
38
n
=
50
Meßbereich
:
20-530
lig
NO
3
/m1
6-50
lig
NO
2
/m1
Abszisse:
o-Kresol
[1]
GRIESS
Ordinate:
GRIESS
nach
Reduktion
Resorcin/ZrOC1
2
Mit
t
=
1,65
(Nitrat)
und
t
=
1,11
(Nitrit)
waren
nach
dem
t-Test
[19]
in
den
Abwei-
chungen
der
Meßwerte
beider
Verfahrenspaare
voneinander
keine
konstanten
Fehler
nach-
weisbar.
Schlußfolgerungen
Neben
den
zur
Routineanalytik
bei
hohen
Probenzahlen
empfohlenen
Nitrat-Bestim-
mungsgängen
über
o-Kresol
[1]
und
insbesondere
ionensensitive
Elektroden
[2]
zeichnet
sich
der
vorgestellte
Weg
einer
quantitativen
Bestimmung
von
Nitrat
mittels
Azofarbstoff-
kupplung
nach
Reduktion
des
Nitrats
zu
Nitrit
durch
einfache
analytische
Operationen
aus.
Das
Verfahren
könnte
daher
vorzugsweise
in
kleinen
Laboratorien
mit
geringem
bzw.
unregelmäßigem
Probenaufkommen
einsetzbar
sein,
wobei
NO
3
/NO
2
-Parallelbestim-
mungen
möglich
werden.
Nitritgehaltsermittlungen
in
Futtermitteln
erfolgen
über
eine
komplexchemische
Reak-
tion
mit
Resorcin
und
Zirkonium(IV)-oxidchlorid
präzise
und
reproduzierbar.
Im
Gegen-
satz
zu
dem
herkömmlichen
Weg
nach
GRIESS
finden
keine
cancerogenen
Amine
Anwendung.
Summary
K.
ZIMMERMANN
and
J.
v.
LENGERKEN:
Analytical
methods
for
nitrate
and
nitrite
in
foods.
Part
III.
Spectro-
photometric
determination
of
nitrate
and
nitrite
by
means
of
sulphanilic
acid/I
-naphthylamine,
and
of
nitrite
by
means
of
resorcinol/
zirconium(IV)
oxychloride
The
nitrate
content
of
foods
may
be
determined
by
means
of
azo-dye
coupling
after
reduction
of
the
nitrate
with
the
aid
of
active
cadmium
produced
in
the
sample
solution.
An
easy
method
for
determining
nitrite
consists
in
the
colorimetric
estimation
of
a
coloured
chelate
formed
from
nitrite,
resorcinol
and
zirconium(IV)
oxychloride.
934
ZIMMERMANN/LENGERKEN
Pemosie
K.
UIIMMEEMAHR
1110.
CD.
AERFEENER:
K
allaJIHTI1Ne
intrpaTa
14
Hirrpwra
B
Kom6Hxopmax.
Coo6m.
3.
Cnex-
TpoclioTomerpwiecxoe
onpege.nemie
Hitrpara
H
HIITp111
-
11
C
HOMOIUb1O
cy.inglioHouori
xHc.norofi/I-Hacbriut-
ammia
H
HHTpaTa
C
nomouisto
pe3op1itHaitiliptcoinist(IV)-oxci4ti.xstopffla
CogepHcamie
HirrpaTa
B
Kom6incopmax
MO)KHO
onpegenHTb
Ha
ocHose
npocHernemist
a3oxpackrreneä
HOCJIC
BOCCTRHOBJ1e111151
Hwrpara
o6pa3oBaHHbim
B
OIIMTHOM
pacraope
aNTRIMbIM
KaHmHem.
J1erKHM
nyTem
onpe,ae.rieHHa
HHTpaTa
oKa3ajlocb
icanopHmerpHmecxoe
onpezteHeime
o6pa3oBaHHoro
113
Hirrpirra,
pe3opuitHa
H
uHpxoHHH(IV)-oiccittucHopHaa
oxpauleHHoro
xenaTHoro
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Zentralstelle
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und
Fütterung,
DDR-4025
Halle,
Schiepziger
Str.
35'
Eingegangen
31.
I.
1979