Isolation of free-living amoebae from soil and vegetables; study of the morphology and pathogenicity of the isolated strains


Ciurea van Saanen, M.

Revue Medicale de la Suisse Romande 101(3): 229-238

1981


In the neighbourhood of Lausanne, Switzerland, amoebae were isolated in all of the 5 soil samples (peat, lawn, leaf mould and 2 vegetable gardens) tested. After cultivation at 28 and 37 deg C, trophozoites which developed at 37 deg killed 100% of mice in 3 to 7 days after intra-nasal inoculation. These were identified by SEM as Naegleria fowleri and Acanthamoeba culbertsoni. Amoebae developing at 28 deg C were non-pathogenic to mice and were identified as N. gruberi and A. rhysodes. Amoebae were also isolated in washing water from vegetable samples in the Canton of Vaud. Amoebae which developed at 37 deg C killed 100% of mice and were identified as A. culbertsoni; none of those developing at 28 deg C (N. gruberi, A. castellanii, Hartmannella glebae, A. rhysodes, A. polyphaga, A. palestinensis and Schizopyrenus sp.) was pathogenic. No cases of amoebal meningo-encephalitis have been reported from Switzerland.

Rev.
Med.
Suisse
Romande,
101:
229-238,
1981
Institut
universitaire
de
microbiologie
(Dir.:
Prof.
D'
V.
Bonitos)
Service
de
parasitologie
(D'
R.
J.
Cavallo-Serra,
prof.
ass.)
Lausanne
L'isolement
d'amibes
libres
dans
le
sol
et
les
legumes;
etude
morphologique
et
pathogenique
des
souches
isolees
par
M.
CIUREA-VAN
SAANEN
RESUME
Les
amibes
libres
semblent
ubiquitaires;
nous
les
avons
recherchees
dans
le
sol
et
dans
les
legumes
de
la
region
lausannoise.
Quatre
souches
ont
pu
'etre
identifiees
a
partir
de
cinq
echantillons
differents
de
sol;
elles
appartiennent
aux
especes
Naegleria
fowleri
(aerobia),
Acanthamoeba
culbertsoni,
Naegleria
gruberi
et
Acanthamoeba
rhysodes;
deux
de
ces
especes
sont
virulentes
pour
la
souris
et
donc
pour
l'homme:
it
s'agit
de
Naegleria
fowleri
et
Acanthamoeba
culbertsoni,
agents
de
la
meningo-encephalite
amibienne
primaire
(MEAP)
humaine.
Quant
aux
isolements
effectues
a
partir
des
legumes,
('etude
morphologique
et
pathogenique
a
indique
qu'il
s'agit
de
plusieurs
especes
des
genres
Acantha-
moeba,
Hartmannella
et
Schizopyrenus,
amibes
non
pathogenes
pour
('animal
de
laboratoire
le
plus
sus-
ceptible,
la
souris.
I.
L'ISOLEMENT
DES
AMIBES
LIBRES
DANS
LE
SOL
L'habitat
ubiquitaire
des
amibes
libres
du
groupe
Limax»
a
permis
a
de
nombreux
chercheurs
de
les
isoler
et
de
les
identifier
non
seulement
dans
les
pisci-
nes,
les
(acs
et
autres
eaux
de
surface,
mais
aussi
dans
les
reservoirs
d'eau,
dans
('air
et
dans
le
sol
humide.
Aux
lndes,
Singh
et
Das
(16)
ont
isole
Naegleria
fow-
leri
(aerobia),
Acanthamoeba
culbertsoni
et
Acantha-
moeba
rhysodes
dans
l'eau
des
egouts
de
Lucknow;
parmi
les
auteurs
qui
les
ont
mises
en
evidence
aux
Etats-Unis,
Chang
(5)
les
a
isolees
dans
les
eaux
du
Missouri,
de
('Ohio
et
du
lac
de
Falmouth;
Hecht
et
coll.
(8)
ont
rapporte
des
cas
de
MEAP
suite
a
une
baignade
aux
sources
d'eau
chaude
en
Californie;
Duma
et
coll.
(6)
ont
decrit
d'autres
cas
qui
se
sont
contamines
dans
le
lac
de
Richmond;
Lyons
et
Ramesh
Kapur
(12)
les
ont
trouvees
dans
30
etangs
d'Albany;
Stevens
et
coll.
(19)
les
ont
isolees
dans
8
)acs
artificiels
et
5
rivieres
en
Floride;
Sawyer
et
coll.
(14)
ont
isole
une
souche
d'Acanthamoeba
culbert-
soni
d'un
egout
pres
de
New
York
et
une
souche
d'Acanthamoeba
hachetti
n.
sp.
a
Maryland.
En
Aus-
tralie,
Carter
(2)
a
decrit
des
cas
de
MEAP
chez
des
sujets
ayant
frequente
des
piscines
alimentees
partiel-
lement
avec
('eau
de
mer.
En
Europe
aussi
la
presence
de
ces
amibes
a
ete
rapportee:
en
Belgique,
Jadin
et
Willaert
(9)
ont
identifie
dans
('eau
des
piscines
des
amibes
libres
des
genres
Naegleria,
Hartmannella
et
Acanthamoeba,
et
Jadin
(9,
10)
les
a
isolees
meme
dans
des
aquariums
prives;
en
France,
Simitzis-Le
Flohic
(15)
a
trouve
ces
amibes
dans
9
de
11
echantil-
Ions
d'eau
provenant
des
reseaux
d'alimentation
urbaine
et
communale
de
Brest;
en
Tchecoslovaquie,
Cerva
et
Novak
(3,
4)
ont
incrimine
l'eau
de
l'Elbe
qui
alimentait
une
piscine
dans
16
cas
de
MEAP
diag-
nostiques;
Kasprzak
et
Mazur
(11)
ont
isole
des
ami-
bes
libres
dans
une
vingtaine
de
)acs
en
Pologne;
en
Roumanie,
Proca
et
coll.
(13)
ont
isole
une
souche
pathogene
d'Acanthamoeba
castellanii
dans
un
lac
d'agrement;
en
Norvege,
Brown
et
Cursons
(1)
ont
prouve
leur
presence
a
Oslo
dans
plusieurs
piscines.
Leur
presence
dans
le
so(,
signalee
la
premiere
fois
par
Sandon
en
1927,
a
ete
confirmee
en
1952
par
229
Singh
(17)
aux
Indes.
Ainsi
que
l'a
decrit
Jadin
(10)
dans
une
publication
concernant
le
pouvoir
de
disper-
sion
de
ces
amibes:
«Leur
dispersion
est
Celle
que
('on
peut
dire
qu'il
n'y
a
point
d'instant
dans
noire
vie
comme
dans
celle
des
animaux
00
nous
ne
soyons
en
contact
avec
Tune
ou
l'autre
espece
de
ces
amibes
libres
et
les
agents
qu'elles
vehiculent.»
Materiel
et
methodes
a)
Echantillons
etudies:
un
echantillon
de
tourbe,
un
de
terre
de
pelouse,
un
de
terreau
de
feuilles
pre-
leve
au
bord
d'une
riviere
et
deux
echantillons
de
terre
vegetate
d'un
jardin
potager.
b)
Milieux
et
solutions:
NNA
(«non
nutrient
agar
»):
solution
d'agar-agar
(Difco)
a
20%
dans
l'eau
dis-
tillee
avec
0,2%
de
NaCI,
sterilisee
a
('autoclave;
ce
milieu
solide
simple
a
ete
coule
en
boites
de
Petri
en
raison
de
10
ml/boite.
c)
Cultures:
11
bacteries:
une
souche
d'Escherichia
coli
de
provenance
humaine
a
ete
cultivee
en
bouillon
nutritif
pendant
18
heures;
0,2
ml
de
cette
culture
ont
ete
etales
a
la
surface
du
NNA
en
Petri;
ces
Petri
ont
ete
incubes
a
37°
C
pendant
18
heures
(NNAB).
2)
amibes:
environ
un
gramme
de
chaque
echantillon
de
sol
a
ete
place
au
centre
des
boites
Petri
NNAB
(au
moins
deux
par
echantillon);
l'un
a
ete
incube
a
37°
C
et
l'autre
a
28°
C
pendant
18
heures.
d)
Observations
microscopiques:
les
amibes
ont
ete
observees
en
microscopie
optique
avec
l'objectif
100
X
a
immersion
et
en
microscopie
electronique
a
balayage
(microscope
type
JEOL-JSM-351;
les
preparations
necessaires
pour
cette
etude
ont
ete
faites
au
Centre
de
microscopie
electronique
de
l'Univarsite
de
Lausanne,
selon
la
methode
classi-
que
qui
comporte:
une
premiere
fixation
avec
10%
glutaraldehyde
dans
du
tampon
cacodylate
0,2
M
a
pH
7,2,
suivie
de
rineages
repetes,
une
post-fixation
au
tetroxyde
d'osmium,
une
deshy-
dratation
dans
des
bains
successifs
d'acetone
et
d'ethanol,
la
filtration
a
('aide
des
filtres
Nuclepore
Shandon,
le
sechage
au
point
critique
et
enfin
la
metallisation
a
('or.
Resultats
Apr
-
es
24
a
48
heures
d'incubation,
it
y
avait
une
crois.
sance
d'amibes
dans
toutes
les
boites;
des
popula-
tions
pures
ont
ete
obtenues
en
developpant
des
clo-
nes
a
partir
d'un
seul
kyste
ou
d'un
seul
trophozbite,
dans
le
but
d'obtenir
des
populations
homogenes
d'amibes.
Les
kystes
ou
les
trophozoItes
soles
ontete
mis
en
culture
dans
d'autres
boites
Petri
avec
NNAB.
C'est
a
partir
des
clones
que
les
epreuves
de
pathoge.
nicite
et
les
etudes
morphologiques
d'identification
ont
ete
effectuees.
Quatre
especes
d'amibes
ont
ete
reconnues
distinctement.
Du
point
de
vue
morpholo-
gigue,
au
microscope
optique
quatre
types
de
kystes
ont
ete
observes:
I.
Des
kystes
de
petite
taille
118
a
20
ayant
une
membrane
externe
simple,
sans
plis
et
dont
le
noyau
etait
situe
au
centre.
II.
Des
kystes
de
taille
moyenne
(15
a
25
p)
a
mem-
brane
lisse
et
pourvus
d'un
noyau
central
d'aspect
vesiculaire.
III.
Des
kystes
a
membrane
externe
ondulee
eta
petit
noyau;
leur
taille
se
situait
entre
15
et
35
,u.
IV.
Des
kystes
de
grande
taille
(30
a
45
p)
a
mem-
brane
externe
finement
reticulee,
a
cytoplasme
granuleux
et
a
noyau
peripherique.
Ces
kystes
ont
ete
egalement
etudies
au
microscope
electronique
a
balayage,
ce
qui
a
permis
d'identifier
les
especes
suivantes:
Naegleria
gruberi
(kystes
a
membrane
simple,
rugueuse,
presentant
des
pores
a
bords
simples),
Naegleria
fowleri
(kystes
a
membrane
lisse
et
a
pores
avec
les
bords
evagines),
Acantha-
moeba
culbertsoni
et
Acanthamoeba
rhysodes
(kystes
a
membrane
ondulee,
presentant
des
plis
plus
ou
moins
profonds,
selon
l'espece).
De
ces
differents
types
de
kystes,
des
subcultures
ont
permis
d'obtenir
une
recolte
massive
de
trophozoites.
C'est
avec
ces
derniers
que
furent
effectuees
les
epreuves
de
virulence,
par
inoculation
intranasale
a
six
souris
pour
chaque
espece
d'amibes.
L'inoculum
consistait
en
0,05
ml
de
suspension
amibienne
dans
l'eau
distillee,
contenant
en
tout
environ
50
000
tro-
phozoites.
Trois
a
sept
jours
apres
('inoculation,
deux
des
couches
testees
se
sont
averees
fortement
yiru-
lentes,
tuant
100%
des
souris
inoculees;
leur
crois.
sance
a
37°
C,
leur
aspect
morphologique
et
leur
230
pathogenicite
concordent
pour
identifier
ces
deux
especes
comme
etant
Naegleria
fowleri
(aerobia)
et
Acanthamoeba
culbertsoni.
Avec
les
cerveaux
des
souris
mortes
on
a
fait
des
frottis
colores
au
moyen
du
trichrome
de
Gomori
(7),
ce
qui
a
permis
la
mise
en
evidence
des
amibes
(fig.
13-171.
Aucune
des
souris
inoculees
avec
les
deux
autres
especes
d'amibes
n'a
manifesto
de
signes
de
meningo-encephalite.
Ce
sont
les
especes
qui
n'ont
pousse
qu'a
28°
C
et
qui
mor-
phologiquement
semblaient
etre
Acanthamoeba
rhysodes
et
Naegleria
gruberi.
Les
resultats
de
l'epreuve
de
virulence
ont
confirme
l'appartenance
des
quatre
especes
d'amibes
isolees
a
partir
du
sol
aux
especes
suivantes:
Naegleria
fowleri
(fig.
3,
7,
8),
Naegleria
gruberi
(fig.
1,
2,
9-11),
Acanthamoeba
rhysodes
(fig.
6)
et
Acanthamoeba
culbertsoni
(fig.
5,
12).
II.
L'ISOLEMENT
DES
AMIBES
LIBRES
DANS
LES
LEGUMES
Materiel
et
methodes
La
presence
et
l'isolement
des
amibes
libres
dans
le
sol
nous
a
incites
a
les
rechercher
dans
quelques
echantillons
de
legumes
frais
du
marche.
a)
Echantillons:
les
legumes
provenaient
de
diffe-
rents
endroits
du
canton
de
Vaud:
salade
verte
de
Lausanne
et
de
Pully,
oignons
verts
de
Prilly,
radis
de
Mex
et
sarriette
de
Preverenges.
bl
Milieu
de
culture:
des
boites
Petri
contenant
du
NNAB.
La
premiere
operation
a
ete
le
lavage
de
ces
legu-
mes;
l'eau
de
lavage
a
ete
recoltee
separement
pour
chacun
des
cinq
echantillons;
la
deuxierne
operation
a
ete
la
concentration
des
amibes
par
filtration
de
l'eau
de
lavage
a
l'aide
des
filtres
Milli-
pore
ayant
des
pores
de
0,45
de
diametre.
cl
La
mise
en
culture:
apres
la
filtration,
chaque
filtre
et
chaque
moitie
retournee
sur
la
gelose
NNAB
a
ete
coupe
en
deux;
ainsi
it
a
ete
possible
d'effec-
tuer
('incubation
de
chaque
echantilloii
a
28°
C
et
a
37°
C.
d)
Le
clonage
a
ete
effectue
pour
chaque
culture
et
chaque
type
de
kystes
d'aspect
different
a
ete
mis
en
culture
separement.
el
Les
subcultures:
ont
eu
comme
but
I'obtention
des
recoltes
massives
de
trophozoItes
pour
l'epreuve
de
virulence.
fl
L'inoculation
experimentale
chez
la
souris:
la
voie
d'inoculation
intranasale
au
moyen
de
la
meme
quantite
d'amibes
que
pour
l'epreuve
effectuee
avec
les
amibes
du
sol
a
ete
utilisee.
g)
L'etude
morphologique
au
microscope
optique
a
ete
enrichie
par
l'etude
au
microscope
electroni-
que
a
balayage,
comrrie
pour
les
amibes
du
sol.
Resultats
Apres
24
heures
d'incubation
a
28°
C
eta
37°
C,
it
y
avait
une
croissance
amibienne
dans
toutes
les
boites
de
Petri;
les
memes
amibes
qui
ont
pousse
a
37°
C
etaient
pathogenes
a
100%
pour
les
souris
qui
ont
survecu
trois
a
sept
jours.
L'etude
au
microscope
electronique
nous
a
permis
d'identifier,
dans
quatre
echantillons,
des
amibes
du
genre
Acanthamoeba
avec
des
kystes
a
membrane
externe
ondulee
otli
les
pores
n'ont
pas
ete
visibles;
dans
le
cinquieme
khan-
tillon
it
y
avait
des
kystes
morphologiquement
sembla-
bles
a
ceux
du
genre
Naegleria,
avec
une
surface
lisse,
sans
plis,
mais
pourvue
de
pores.
II
s'agissait
de
kystes
de
Naegleria
gruberi
(fig.
23,
33);
cette
amibe,
inoculee
chez
la
souris,
s'est
montree
apathogene.
Au
test
de
virulence
une
seule
espece
s'est
averee
pathogene:
it
s'agit
d'Acanthamoeba
culbertsoni
(fig.
28,
29,
35);
les
autres
especes:
Acanthamoeba
castellanii,
Hartmannella
glebae,
Acanthamoeba
rhysodes,
Acanthamoeba
polyphaga,
Acanthamoeba
palestinensis
(fig.
18-27,
30,
32-34)
et
Schizopyrenus
sp.
(fig.
19,
31)
n'ont
pas
ete
virulentes
pour
la
souris.
DISCUSSION
Le
fait
que
plusieurs
especes
d'amibes
libres
du
groupe
Limax
(pathogenes
et
non
pathogenes)
soient
presentes
dans
le
sol
et
les
legumes
ne
manque
pas
d'importance
dans
l'epiderniologie
de
la
MEAP,
merne
si
leur
ingestion
et
leur
presence
dans
l'intestin
231
<••
4,
Fig.
1-6.
Amibes
des
genres
Naegleria
et
Acanthamoeba
isolees
du
sol:
Fig.
1:
kystes
et
trophozoltes
de
Naegleria
gruberi
Fig.
2:
kystes
de
Naegleria
gruberi
Fig.
3:
kystes
de
Naegleria
fowleri
1=
aerobia)
Fig.
4:
kystes
d'Acanthamoeba
polyphaga
Fig.
5:
kystes
d'Acanthamoeba
culbertsoni
Fig.
6:
kystes
d'Acanthamoeba
rhysodes
232
8
10
11
1--
,
do.
ti
.s—
Fig.
7-12.
Amibes
du
sol
au
microscope
electronique
a
balayage:
Fig.
7,
8:
kystes
de
Naegleria
fowleri
Fig.
9-11:
kystes
de
Naegleria
gruberi
Fig.
12:
kystes
d'Acanthamoeba
culbertsoni
'
,e7
,
77
233
f
,
ef
14
13
4
r
i•
17
Fig.
13-17.
Amibes
libres
pathogenes
dans
les
cerveaux
des
souris:
Fig.
13,
14:
Naegleria
fowleri
Fig.
15-17:
Acanthamoeba
culbertsoni
1
.15
-
afi
ti
i
.--,........
c
i
4
1
,,
.
40,
h,
IL
---,
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'•
A-
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ti
p
--
'"'"A
..,#'4
4
:
,
a
)44
".
27
Va.
f.
AM.
29
Fig.
24-29.
Amibes
libres
isolees
sur
les
legumes:
Fig.
24:
kystes
d'Acanthamoeba
sp.
Fig.
25:
kystes
d'Acanthamoeba
polyphaga
Fig.
26:
kystes
d'Acanthamoeba
castellanii
Fig.
27:
kystes
d'Hartmannella
glebae
Fig.
28,
29:
kystes
d'Acanthamoeba
culbertsoni
236
,
3
.
2
-6
1
pr
cp
,
33
35
s
34
31
0
14
,
-
'
S
LR
4
30
Fig.
30-35.
Amibes
libres
des
legumes
au
microscope
electronique
a
balayage:
Fig.
30:
Fig.
31:
Fig.
32:
Fig.
33:
Fig.
34:
Fig.
35:
Acanthamoeba
palestinensis
Schizopyrenus
sp.
Acanthamoeba
rhysodes
Naegleria
gruberi
Acanthamoeba
polyphaga
Acanthamoeba
culbertsoni
237
ne
les
rendent
pas
pathogenes.
II
faut
a
ce
sujet
signa-
ler
qu'en
Suisse
aucun
cas
de
MEAP
n'a
ete
decrit
jusqu'a
present.
REMERCIEMENTS
Nous
exprimons
notre
vive
reconnaissance
au
D'
S.
R.
Das
(Central
Drug
Research
Institute,
Lucknow,
India),
invite
grace
a
la
Fondation
de
Recherche
F.
Hoffmann-La
Roche,
pour
son
aide
au
long
des
expe-
riences
effectuees
a
l'Institut
universitaire
de
micro-
biologie
de
Lausanne.
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Adresse:
Mme
D'
med.
vet.
M.
Ciurea-Van
Saanen,
Institut
universitaire
de
microbiologie,
Service
de
parasitologie,
rue
du
Bugnon
44,
1011
Lausanne.
238