The toxic action of cultures of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis on honey bees (Apis mellifera)


Krieg, A.

Zeitschrift für Pflanzenkrankheiten und Pflanzenschutz 80(8): 483-486

1973


The effect of whole non-sporulated cultures of B. cereus (strain C-47) and B. thuringiensis (strain 1/5 and 111/36) and of fractions of the culture filtrate has been tested an honey bees (Apis mellifera). Two fractions have been found to be toxic for adult bees alter oral administration: 1. the well-known thermostable exotoxin („ß-exotoxin"), evidently a nucleoside, which was produced here only by strain 1/5 of B. thusingiensis (serotype H1); 2. a thermolabile exotoxin („α-exotoxin"?) probably proteinic in nature, which was produced by all strains tested. Only the latter thermolabile exotoxin was inactivated during the process of sporulation. Because sporulated cultures of B. cereus strain C-47 and B. thuringiensis strain 111/36 (serotype H3) contain no longer an insecticidal exotoxin, they are not harmful for bees.

Uber
die
toxische
Wirkung
von
Bacillus
cereus-
und
Bacillus
thuringiensis-Kulturen
auf
die
Honigbiene
(Apis
mellifera)
About
toxic
effects
of
cultures
of
Bacillus
cereus
and
Bacillus
thuringiensis
an
honey
bees
(Apis
mellifera)
ALOYSIUS
KRIEG
Biologische
Bundesanstalt,
Institut
für
biologische
Schädlingsbekämpfung,
Darmstadt
Manuskript
eingegangen
am
13.
8.
1973
Bacillus
thuringiensis
produziert
während
der
Sporulation
parasporale
Kristalle,
die
Protoxin-Charakter
besitzen.
Diese
sind
für
eine
Reihe
von
Lepidopteren-Larven
toxisch,
haben
aber
ebenso
wie
die
Sporen
keine
Wirkung
auf
Bienen
(LD
50
»
0,1
mg/Biene).
Deshalb
sind
zur
Bekämpfung
von
Schad-Lepidopteren
geeignete
kommerzielle
B.
thu-
ringiensis-Präparate,
die
außer
Sporen
nur
parasporale
Kristalle
enthalten,
für
Bienen
unschädlich
(WiLsoN
1962,
STUTE
1963,
KRIEG
1964).
Vegetative
Zellen
von
B.
thuringiensis
produzieren
indessen
noch
andere
Stoffe,
die
für
Insekten
toxisch
sind.
Diese
sind
auch
dafür
verantwortlich,
daß
bei
Bienen
eine
der
Keimzahl
korrelierte
Mortalität
zu
beobachten
ist,
wenn
sie
mit
nicht
sporulierten
B.
thuringiensis-Kulturen
gefüttert
werden
(GUKASJAN
1958,
KRIEG
u.
HERFS
1963,
MARTOURET
u.
EUVERTE
1964).
Erste
Versuche,
diese
Faktoren
zu
analysieren,
führten
zu
dem
Ergebnis,
daß
das
hitzestabile
sog.
ß-Exotoxin
(fly
factor)
auf
Bienen
toxisch
wirkt
(KRIEG
U.
HERFS
1963,
CANTWELL
u.
Mitarb.
1966).
Neuere
Versuche,
über
die
hier
berichtet
werden
soll,
weisen
jedoch
auf
die
Beteiligung
eines
weiteren
Faktors
hin.
1
Material
und
Methode
1.1
Bakterien-
und
Toxin
-Präparate
Mit
den
ausgewählten
Bakterien
-Stämmen
(1/5
und
111/36
von
Bacillus
thuringiensis
und
C-47
von
Bacillus
cereus)
wurde
zunächst
eine
Vorkultur
hergestellt
und
mit
ihr
das
Kulturmedium
für
die
Submerskultur
beimpft.
Als
Medium
für
die
Bakterienkultur
diente
eine
auf
pH
7,8
gepufferte
Hefeextrakt-Pepton-Brühe
(1
+1%
w/v).
Bevor
im
Brutschüttler
bei
25°
C
die
vegetative
Phase
der
Bakterienentwicklung
abgeschlossen
war
(mikroskopische
Kontrolle),
wurde
abgeerntet
(ca.
12
Std.
post
inoculationem).
Zur
Gewinnung
von
Toxinfraktionen
wurden
die
vegetativen
Zellen
mittels
Zentri-
fuge
abgeschleudert,
der
überstand
anschließend
fi
ltriert
und
in
2
Portionen
geteilt.
Aus
dem
einen
Teil
des
klaren
Filtrates
ließ
sich
die
Proteinfraktion
durch
Sättigung
mit
Ammoniumsulfat
(über
Nacht
im
Kühlschrank)
aussalzen.
Das
Präzipitat
wurde
dann
mit
gesättigter
Ammoniumsulfatlösung
zweimal
ausgewaschen
und
anschließend
auf
1
/
4
des
ursprünglichen
Volumens
mit
Aqua
dest.
aufgefüllt.
Der
zweite
Teil
des
klaren
Filtrats
wurde
15
Min.
auf
120°
C
erhitzt
und
diente
zum
Test
auf
hitzestabiles
ß-Exotoxin.
484
Krieg
8/73
PflKrankh.
1.2
Blotest
Die
Tests
wurden
an
adulten
Bienen
(Stockbienen
oder
Flugbienen)
durchgeführt.
Je
20
kamen
in
einen
genormten
Käfig
(Innenmaße
6
x
6
x
2
cm)
in
den
jeweils
von
oben
ein
Futterröhrchen
hineinragte.
Dieses
enthielt
die
zu
testenden
Präparate
in
wässriger
Lösung.
Die
Kontrolle
erhielt
entweder
nur
Wasser
oder
aber
Kulturmedium
unter
Zusatz
von
0,03
%
Aureomycin
(zur
Verhinderung
von
Bakterienwachstum).
Alle
den
Bienen
verfütterten
Präparate
erhielten
einen
Zusatz
von
50
%
Rohzucker.
Jeder
Ansatz
bestand
aus
40
Tieren.
Der
Versuch
lief
als
Lebensdauer
-Versuch
unter
folgenden
Bedingungen:
22-25
°
C
Temperatur
und
45-50
%
rel.
Luftfeuchte.
Nach
dem
Absterben
erfolgte
eine
mikroskopische
Untersuchung
der
Bienen
auf
Befall
durch
B.
thuringiensis
bzw.
andere
Pathogene.
2
Ergebnisse
Bei
Verwendung
der
Gesamtkultur
von
B.
thuringiensis
bzw.
B.
cereus
lag
die
Mor-
talität
der
Honigbienen
nach
8
Tagen
bei
über
50
%.
Nach
Applikation
des
mit
Ammoniumsulfat
gefällten
Präzipitats
(4fach
konzentriert
gegenüber
dem
Gehalt
des
nativen
Filtrats)
betrug
die
Mortalität
nach
8
Tagen
zwischen
80
und
100
7
0
,
und
M
100
50
/
c
rf
.6
10
(d3
Abb
1.
Absterbekurven
von
Flug-
bienen,
die
mit
Bacillus-Präparaten
gefüttert
wurden.
Abzisse:
Versuchszeit
in
Tagen
Ordinate:
Mortalität
in
Prozentwer-
ten
Kurve
A:
nicht
sporulierte
Gesamt-
kultur
von
Bacillus
thuringiensis
1
/
5
Kurve
B:
nicht
sporulierte
Gesamt-
kultur
von
Bacillus
cereus
C-47
Kurve
C:
4fach
konzentrierte
(4)-
Exotoxin-Fraktion
von
Bacillus
thu-
ringiensis
1
/
5
Kurve
D:
4fach
konzentrierte
(4)-
Exotoxin-Fraktion
von
Bacillus
ce-
reus
C-47
(Die
bei
2
Meßpunkten
angegebenen
Konfidenzgrenzen
entsprechen
einer
Irrtumswahrscheinlichkeit
von
5
%)
zwar
bei
beiden
o.
g.
Bacillus-Arten
(vgl.
Abb.
1).
Erhitztes
Kulturfiltrat
erwies
sich
nur
im
Falle
von
B.
thuringiensis
Stamm
1/5
wirksam
(Mortalität
nach
8
Tagen
über
50
%
)
.
3
Diskussion
Im
Medium
(Filtrat
bzw.
überstand)
von
nicht
sporulierten
Kulturen
des
B.
thurin-
giensis
können
zwei
bienenwirksame
wasserlösliche
Toxine
vorkommen.
Das
eine
ist
ein
hitzestabiles
Exotoxin,
das
nur
von
einem
der
hier
getesteten
Stämme
produziert
wurde,
nämlich
von
dem
zum
Serotyp
H
1
gehörigen
B.
thuringiensis-Stamm
1/5.
Hier-
bei
dürfte
es
sich
um
das
insektizide
Nucleosid
(fiy
factor)
handeln,
das
HEIMPEL
(
1
9
67
)
als
13-Exotoxin
bezeichnet
hat.
PflKrankh.
8/73
Wirkung
von
Bacillus-Kulturen
auf
Honigbiene
485
Ein
zweites
insektizides
Exotoxin,
das
von
allen
geprüften
Stämmen
produziert
wurde,
ist
dagegen
hitzelabil
und
besitzt
offenbar
Proteinnatur
(vgl.
KRIEG
1971).
Dement-
sprechend
ist es
mit
Ammoniumsulfat
aussalzbar.
Seine
Wirkung
gegenüber
Bienen
ist
so
stark,
daß
bei
Stämmen,
die
auch
das
o.
g.
ß-Exotoxin
bilden,
die
Wirkung
der
nicht
sporulierten
Gesamtkultur
fast
ausschließlich
durch
den
Gehalt
an
hitzelabilem
Exotoxin
bestimmt
wird.
Beide
Exotoxine
werden
von
vegetativen
Zellen
produziert.
Im
Gegensatz
zu
dem
hitzestabilen
Exotoxin
wird
das
hitzelabile
Exotoxin
während
der
Sporulationsphase
weitgehend
inaktiviert,
so
daß
Medien
von
sporulierten
Kulturen
nur
dann
gegen
Bienen
toxisch
sind,
wenn
sie
das
hitzestabile
sog.
ß-Exotoxin
enthalten.
Während
also
sporulierte
Kulturen
von
B.
thuringiensis
1/5
noch
bienenwirksam
sind,
ist
dies
bei
sporulierten
Kulturen
von
B.
thuringiensis
111/36
(Serotyp
H
3
)
und
B.
cereus
C-47
nicht
der
Fall.
HEIMPEL
hatte
1955
die
Wirkung
von
B.
cereus-
und
B.
thuringiensis-Stämmen
auf
Hymenopteren
(Blattwespen
-Larven)
mit
der
Lecithinase-Leistung
der
Bakterienstämme
korreliert
und
den
Wirkstoff
später
(HEIMPEL
1967)
als
a-Exotoxin
bezeichnet.
Wahr-
scheinlich
dürfte
es
sich
auch
bei
dem
hier
beschriebenen
bienenwirksamen
hitzelabilen
Toxin
aus
B.
cereus-
und
B.
thuringiensis-Kulturen
um
dieses
sog.
a-Exotoxin
handeln.
Allerdings
ließ
sich
im
vorliegenden
Fall
kein
Zusammenhang
zwischen
der
Bienen-
toxizität
der
Präparate
und
ihrer
Lecithinase-Wirksamkeit
nachweisen.
Es
zeigte
sich
vielmehr,
daß
der
stärkste
Lecithinase-Bildner
(B.
thuringiensis
111/36)
die
geringste
und
der
schwächste
Lecithinasebildner
(B.
cereus
C-47)
die
stärkste
Bienenwirksamkeit
aufwies.
Zusammenfassung
Die
Wirkung
von
nicht-sporulierten
Kulturen
von
B.
cereus
(Stamm
C-47)
und
B.
thu-
ringiensis
(Stamm
1/5
und
11
1
/
3
6)
und
von
Fraktionen
des
jeweiligen
Kulturfiltrates
wurde
an
erwachsenen
Honigbienen
(Apis
mellifera)
getestet.
Zwei
Fraktionen
erwie-
sen
sich
nach
Verfütterung
als
toxisch
für
die
Bienen:
1.
das
wohlbekannte
thermostabile
Exotoxin
(„ß-Exotoxin"),
offenbar
ein
Nucleosid,
welches
hier
nur
durch
den
Stamm
1/5
von
B.
thuringiensis
(Serotyp
H
1
)
produ-
ziert
wird;
2.
ein
thermolabiles
Exotoxin
(„a-Exotoxin"?),
wahrscheinlich
ein
Protein,
das
von
allen
geprüften
Stämmen
gebildet
wird.
Nur
dieses
thermolabile
Exotoxin
wird
während
des
Sporulationsprozesses
inaktiviert.
Da
also
sporulierte
Kulturen
von
B.
cereus
(Stamm
C-47)
und
B.
thuringiensis
Stamm
111/36
(Serotyp
H
3
)
kein
insektizides
Exotoxin
mehr
enthalten,
sind
sie
für
Bienen
nicht
gefährlich.
Summary
The
effect
of
whole
non-sporulated
cultures
of
B.
cereus
(strain
C-47)
and
B.
thurin-
giensis
(strain
1
/
5
and
111/36)
and
of
fractions
of
the
culture
fi
ltrate
has
been
tested
an
honey
bees
(Apis
mellifera).
Two
fractions
have
been
found
to
be
toxic
for
adult
bees
alter
oral
administration:
1.
the
well-known
thermostable
exotoxin
(„ß-exotoxin"),
evidently
a
nucleoside,
which
was
produced
here
only
by
strain
1/5
of
B.
thusingiensis
(serotype
H
1
)
;
486
Krieg
8/73
PflKrankh.
2.
a
thermolabile
exotoxin
(„a-exotoxin"?)
probably
proteinic
in
nature,
which
was
produced
by
all
strains
tested.
Only
the
latter
thermolabile
exotoxin
was
inactivated
during
the
process
of
sporulation.
Because
sporulated
cultures
of
B.
cereus
strain
C-47
and
B.
thuringiensis
strain
111/36
(serotype
H
3
)
contain
no
longer
an
insecticidal
exotoxin,
they
are
not
harmful
for
bees.
Literatur
CANTWELL,
G.
E.,
D.
A.
KNOX,
T.
LEHNERT,
A.
S.
MICHAEL:
Mortality
of
the
honey
bee,
Apis
mellifera,
in
colonies
treated
with
certain
biological
insecticides.
J.
In-
vert.
Path.
8,
228-233,
1966.
GUKASJAN,
A.
B.:
(Die
Anfälligkeit
von
Bienen
für
den
Erreger
der
Krankheit
des
Sibirischen
Arvenspinners.)
Welevodstvo
11,
46-48,
1958
(Russ.).
HEIMPEL,
A.
M.:
Investigations
of
the
mode
of
action
of
strains
of
Bacillus
cereus
Fr.
and
Fr.
pathogenic
for
the
larch
sawfly,
Pristiphora
erichsonn
(Htg.).
Can.
J.
Zool.
33,
311-326,
1955.
HEIMPEL,
A.
M.:
A
critical
review
of
Bacillus
thuringiensis
var.
thuringiensis
Berliner
and
other
crystalliferous
bacteria.
A.
Rev.
Ent.
12,
287-322,
1967.
KRIEG,
A.:
über
die
Bienenverträglichkeit
verschiedener
Industriepräparate
des
Bacillus
thuringiensis.
Anz.
Schädlingsk.
37,
39-40,
1964.
KRIEG,
A.:
Concerning
a-Exotoxin
produced
by
vegetative
cells
of
Bacillus
thuringiensis
and
Bacillus
cereus.
J.
Invert.
Path.
17,
134-135,
1971.
KRIEG,
A.,
W.
HERFS:
über
die
Wirkung
von
Bacillus
thuringiensis
auf
Bienen.
Ent.
exp.,
appl.
6,
1-9,
1963.
MARTOURET,
D.,
G.
EUVERTE:
The
effect
of
Bacillus
thuringiensis
Berliner
preparations
an
the
honey
bee
under
conditions
of
forced
feeding.
J.
Insect.
Path.
6,
198-203,
1964.
STUTE,
K.:
über
die
Wirkung
von
Bacillus
thuringiensis
auf
die
Honigbiene
(Apis
mellifera
L.).
NachBl.
dt.
PflSchutzdienst
Braunschweig
15,
102-104,
1963.
WILSON,
W.
T.:
Observations
of
the
effects
of
feeding
large
quantities
of
Bacillus
thuringiensis
Berliner
to
honey
bees.
J.
Insect.
Path.
4,
269-270,
1962.
Anschrift
des
Verfassers:
Dr.
A.
Krieg,
61
Darmstadt,
Heinrichstraße
243.